La técnica de biología molecular llamada Reacción en Cadena de la Polimerasa  (PCR, por sus siglas del inglés: ‘Polymerase Chain Reaction’) tiene variados aportes en la industria agrícola. Por un lado, es ampliamente utilizada en investigación básica para entender mecanismos moleculares que se desarrollan en las plantas. Y en un ámbito más aplicado, permite determinar la genuinidad de una variedad de fruta u hortaliza o identificar la presencia de microorganismos que causan enfermedades y, con ello, determinar una manera de enfrentarlas o prevenirlas.  

“Tanto en Chile como a nivel internacional, la forma más común para la determinación de la genuinidad o identificación varietal de las plantas se realiza mediante el análisis de características morfológicas como la forma de las hojas, flores y frutos. El problema de este sistema de identificación es que existen variedades que presentan características muy similares y son muy difíciles de diferenciar entre sí. Además, estas diferencias a nivel morfológico pueden ser generadas por múltiples factores, como el manejo de las plantas, enfermedades que las podrían estar afectando o el ambiente al que están expuestas y se puede requerir de varios años de observación de las plantas para confirmar las diferencias entre variedades”, explica la Doctora Verónica Guajardo, investigadora principal de la línea de Mejoramiento Genético del Centro de Estudios Avanzados en Fruticultura (CEAF).

Una alternativa o complemento es el sistema de identificación varietal utilizando técnicas de biología molecular como el PCR, que hoy está permitiendo identificar diferencias entre las plantas a nivel del ADN en tiempos cortos. “Reduce al mínimo las probabilidades de error por mala identificación de las plantas y, además, es posible realizar análisis durante todo el año, ya que se puede utilizar distintos tipos de tejidos vegetales, como hojas y yemas”, precisa la especialista.

Doctora Verónica Guajardo, investigadora principal de la línea de mejoramiento genético del Centro de Estudios Avanzados en Fruticultura (CEAF).

Verónica Guajardo aclara que la técnica de PCR permite identificar y multiplicar millones de veces regiones particulares del ADN, conocidas como marcadores moleculares, que son específicas y se mantienen invariables para cada variedad analizada. “Los marcadores moleculares más utilizados para realizar análisis de genuinidad varietal son los microsatélites, que corresponden a secuencias de ADN repetidas y el número de repeticiones es característico de cada variedad dentro de una especie. Con este análisis se puede informar a un viverista o productor que las plantas corresponden a una variedad determinada o detectar algún posible problema de identificación, como podría ser una mezcla de variedades”.

– ¿En qué consiste el análisis, cuánto tiempo demora y cuáles son los resultados que entrega? 

– Para realizar los análisis de genuinidad varietal se toma una muestra de tejido vegetal, como hojas o una ramilla con yemas, que se guardan en una bolsa hermética y ésta debe ser cuidadosamente rotulada con información de la planta o árbol a analizar. Luego, estas muestras son transportadas al laboratorio, donde son procesadas para la obtención del ADN y posteriormente analizadas a través de PCR convencional. Finalmente, se utiliza otra técnica llamada electroforesis, que nos permite visualizar los resultados de la amplificación del ADN para cada muestra de manera individual.

Actualmente, utilizando la metodología de PCR disponible en Chile, a la que llamaremos PCR convencional en este contexto, los resultados de los análisis de identificación varietal pueden ser obtenidos en tres o más semanas, dependiendo del número de muestras a analizar. Los resultados permiten indicarle a un viverista o productor si las plantas corresponden a la variedad esperada y, en caso de que se encuentren plantas que no correspondan a la variedad de interés, se podría llegar a identificar a qué variedad corresponden las plantas fuera de tipo.

–  Dados los avances existentes, ¿es posible desarrollar otras técnicas que permitan acortar los tiempos, aumentar la especificidad del análisis o ampliarlos a otros ámbitos del material vegetal (por ejemplo: sanidad vegetal)? 

–  En el ámbito de los análisis de identificación varietal, es posible utilizar variaciones del PCR, como el qPCR-HRM (un tipo de PCR cuantitativo de alta resolución), que permite realizar la identificación de los marcadores moleculares para cada una de las variedades de manera más rápida que la técnica de PCR convencional, utilizando equipos y metodologías de mayor resolución que las utilizadas para PCR convencional. En el área de sanidad vegetal, tres versiones del PCR [PCR convencional, qPCR (o PCR cuantitativo) y qPCR-HRM] pueden ser utilizadas para detección de patógenos, como virus, bacterias y hongos que afectan a las plantas, siendo el qPCR y qPCR-HRM más rápidos y sensibles que el PCR convencional.

– ¿En qué otros cultivos se podría usar?  

– Teóricamente, los análisis de identificación varietal se pueden realizar para cualquier especie vegetal (frutales, semillas, hortalizas, flores, especies forestales, entre otros), ya que se utiliza su ADN y este se encuentra presente en todas las especies. Son necesarios ciertos requisitos, por ejemplo, que sea posible la extracción de ADN de buena calidad ya que se conocen especies en donde la obtención de ADN es muy compleja. Otro requisito es contar con información de estas regiones particulares del ADN, llamadas marcadores moleculares, que permiten distinguir a las distintas variedades. Esto significa que se requiere un periodo de investigación importante para ajustar las condiciones que permitan desarrollar un sistema de identificación varietal que luego puede transformarse en un servicio.

EL DESAFÍO: LOGRAR IDENTIFICAR PEQUEÑAS VARIACIONES EN EL ADN

– ¿Hay alguna especie o variedad en la que no sea posible aplicar esta técnica u obtener la información que se requiere para determinar si es genuina o no?    

–  Actualmente, uno de los grandes desafíos que se pueden superar a través del uso de nuevas tecnologías en el área de la genuinidad varietal es la posibilidad de diferenciar ‘variedades clones’, que son bastantes comunes, por ejemplo, en manzano, y que no es posible diferenciar entre sí utilizando marcadores de microsatélites. En esta especie se puede encontrar una serie de variedades que han sufrido ligeros cambios a nivel de su ADN, o mutaciones puntuales, que generan cambios, por ejemplo, a nivel de la fruta.

El desafío para quienes trabajamos en esta área es la búsqueda e identificación de estas pequeñas variaciones en el ADN, lo que implica un proceso de investigación y validación científica para luego poder ser aplicada en un servicio de identificación varietal. Un caso notable en donde se pudo realizar este tipo de identificación es en la variedad comercial de mandarina sin semilla, ‘Tango’, que fue obtenida a partir de una mutación de la variedad ‘W. Murcott’. Debido a la importancia económica de esta variedad sin semilla, y a través del trabajo de un consorcio de empresas y centros de investigación en España, se logró identificar estos sectores de ADN únicos de Tango que permiten diferenciarla de otras variedades de mandarina y actualmente se encuentra disponible este servicio de identificación varietal en España para todo el mundo.

– ¿Esta técnica debiera ser aplicada por los viveros como una manera de determinar la genuinidad y estado fitosanitario del material vegetal antes de comercializarlo?   

– Así es. La técnica de PCR ya es utilizada por varios viveros chilenos y lo ideal es que sea aplicada en múltiples puntos de la cadena productiva del sector frutícola, con la finalidad de establecer huertos de los que se tenga certeza respecto a la genuinidad varietal del material vegetal y a su estado fitosanitario. La idea es que estos servicios sean ofrecidos por los laboratorios a una razón costo/beneficio que sea atractiva para su utilización permanente por los viveros y también por productores que necesiten confirmar que sus plantas corresponden a la variedad esperada o que se encuentran libres de microorganismos que causan enfermedades.

– ¿Qué tan usado es este análisis de PCR en otros países para determinar la genuinidad varietal o sanidad del material vegetal?  

–  La realidad más conocida por nosotros es la española, donde hay un constante análisis en viveros y en huertos productivos sobre el material vegetal que se está produciendo, tanto para confirmar la identificación varietal de las plantas como la sanidad vegetal de este material. Existen empresas y centros de investigación que han realizado investigación para desarrollar tecnologías que les permiten procesar miles de muestras mensualmente debido a las exigencias que existen en el mercado de propagación de plantas. Además, la identificación varietal a través de PCR es una herramienta de prueba ante la justicia en casos de propagación de material vegetal protegido sin que se cuente con autorización del obtentor.

Nadia Cáceres, bioquímico que integra el equipo liderado la Doctora Verónica Guajardo en el laboratorio del CEAF.

USANDO PCR ES POSIBLE IDENTIFICAR CUALQUIER MICROORGANISMO

– ¿Es posible que haya microorganismos que causan enfermedades en las plantas y que no se puedan identificar con esta técnica?  

– Teóricamente es posible identificar a cualquier microorganismo utilizando PCR, pero tal como sucede para la identificación varietal, en el área de fitopatología se debe realizar un completo análisis del material genético del microorganismo que causa una determinada enfermedad, para identificar regiones específicas que lo distinguen de otros microorganismos.

Existen publicaciones científicas que describen cómo detectar y diferenciar los principales patógenos que afectan a las plantas y hay grupos de investigación en Chile y todo el mundo que están constantemente trabajando en la identificación de nuevas cepas o variantes que van apareciendo, como lo que actualmente se hace para la identificación de nuevas variantes del SARS-CoV-2, el virus que causa el Covid-19. Como en todas las técnicas, hay límites o umbrales de detección del material genético, es decir, si hay una muy baja cantidad de un microorganismo, la técnica podría no permitir su detección. Es por esto que se han desarrollado métodos de detección más sensibles y específicos a través del uso de qPCR y qPCR-HRM, ya que permiten detectar cargas menores de virus, por ejemplo, que la técnica de PCR convencional.

La toma de muestras para la detección de patógenos se debe realizar a partir de las zonas donde éstos se mueven o concentran, como el floema para la detección de virus vegetales. Además, se recomienda el uso de muestras compuestas, es decir, que provengan de distintas partes de la planta para que sea más representativa y aumentar las posibilidades de detección.

– ¿Qué tipo de mutaciones pueden ocurrir en una especie frutal? ¿O cuáles se han detectado? 

– Pueden ocurrir mutaciones espontáneas y puntuales en una secuencia de ADN como los SNPs (del inglés ‘Single Nucleotide Polymorphisms’), provocados generalmente por errores durante la división de las células de las plantas. Estas mutaciones normalmente son reparadas por las células y si se mantienen, habitualmente no afectan las características de las plantas, por lo que no son detectadas por nosotros.

En algunos casos se pueden generar mutaciones que generan cambios visibles y pueden mejorar una característica, por ejemplo, produciendo fruta que tiene un color más intenso y eso la hace más atractiva. También se pueden generar mutaciones al someter un tipo de tejido vegetal a radiación como parte de un programa de mejoramiento genético para obtención de nuevas variedades. De esta manera, por ejemplo, se han obtenido variedades autofértiles en cerezo y variedades sin semilla en mandarina.

– En el caso de las técnicas de qPCR y qPCR-HRM, ¿qué otros beneficios tienen en el área de sanidad vegetal? 

– La técnica de PCR en general puede permitir la detección de patógenos antes de que se observen síntomas de las enfermedades que generan, lo que puede ser muy útil en los viveros para evitar la multiplicación de material vegetal con presencia de patógenos. Además de reducir los tiempos para obtención de resultados comparado con el PCR convencional, ambas técnicas permiten detectar patógenos con mayor sensibilidad. Es decir, a través de qPCR o qPCR-HRM se podría detectar la presencia de un patógeno como un virus que podría no ser detectado a través de PCR convencional. Además, estas técnicas hacen posible detectar varios patógenos a la vez (en un único tubo se puede detectar más de un virus o bacteria), mientras que eso puede no ser posible con la técnica de PCR convencional.

– ¿Qué desafíos considera que se presentan en Chile en cuanto a la genuinidad varietal, trazabilidad, sanidad de plantas, etc.? ¿De qué manera crees que se pueden enfrentar? 

– Existen muchos y variados desafíos para la fruticultura, debido principalmente a su carácter dinámico y en este tema en específico, debido al recambio varietal que genera un alto número de variedades disponibles que deben estar correctamente identificadas. Como investigadora de un Centro de Investigación Regional como lo es CEAF, me he propuesto desarrollar proyectos de investigación aplicada que buscan dar respuesta a necesidades del sector frutícola, trabajando estrechamente con los actores de este sector como viveristas y productores. A través de actividades con ellos, queremos motivar a las empresas para que, una vez disponibles las tecnologías, éstas sean incorporadas a sus cadenas productivas.

Chile es reconocido mundialmente como un gran productor frutícola y creo que el desafío para el sector es el de mantener ese título, incorporando un trabajo en conjunto entre los actores del sector y el mundo científico. Nosotros como CEAF buscamos aportar en la mejora de la trazabilidad y sanidad vegetal del material vegetal producido en el país, con el fin de mantener la competitividad del sector frutícola chileno a nivel internacional.

Fotografías de texto: Leslie Salamanca.

Fuente: Redagricola.com